CNSH. Nguyễn Thị Ngọc Huệ - IVMD Bình Dương

1. Giới thiệu
Đông lạnh là một trong những kỹ thuật phổ biến trong hỗ trợ sinh sản, tuỳ theo từng loại giao tử mà việc đông lạnh sẽ được thực hiện bằng các phương pháp khác nhau. Hai phương pháp đông lạnh phổ biến được sử dụng trong hỗ trợ sinh sản là đông lạnh chậm và thuỷ tinh hoá. Trong đó, phương pháp thuỷ tinh hoá là phương pháp được sử dụng chủ yếu trong đông lạnh noãn hiện nay, dựa trên nguyên lý đông lạnh cho phép hoá rắn các tế bào và môi trường ngoại bào thành trạng thái giống như thuỷ tinh mà không tạo tinh thể đá, từ đó giảm những tổn thương đến noãn sau đông lạnh.
Về đối tượng, đông lạnh noãn có thể được chỉ định trong trường hợp người chồng không lấy được đủ mẫu tinh trùng vào ngày thủ thuật, đông lạnh noãn tích luỹ cho nhóm bệnh nhân đáp ứng kém với kích thích buồng trứng hay đông lạnh nhằm mục đích giảm nguy cơ quá kích buồng trứng. Đây cũng được đánh giá là kỹ thuật phù hợp cho những phụ nữ muốn đông lạnh noãn vì lý do y tế như ung thư, suy buồng trứng. Cuối cùng, việc đông lạnh noãn còn phù hợp với nhu cầu của những phụ nữ muốn bảo tồn khả năng sinh sản khi lớn tuổi nhưng chưa sẵn sàng mang thai [1].
Bài viết này nhằm mục đích tổng hợp các yếu tố tác động đến noãn và những thay đổi về chất lượng noãn sau quá trình đông lạnh – rã đông.

2. Chất bảo vệ đông lạnh (Cryoprotectant agent - CPA) và các yếu tố liên quan
Noãn là tế bào có các đặc điểm nhạy cảm với các thay đổi vật lý và hoá học, do đó việc bổ sung CPA vào môi trường đông lạnh được thực hiện nhằm mục đích bảo vệ noãn khỏi những tổn thương, đặc biệt là sự hình thành tinh thể đá. Hai loại CPA được sử dụng trong đông lạnh là CPA thẩm thấu và CPA không thẩm thấu. CPA thẩm thấu là những CPA có trọng lượng phân tử nhỏ (nhỏ hơn 400Da) và có thể thấm qua màng tế bào, bao gồm các CPA lycerol, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide (DMSO), propylen glycol hoặc 1,2 propanediol (PrOH). CPA không thẩm thấu là những CPA có trọng lượng phân tử cao hơn và không thấm qua màng tế bào, một số loại có thể kể đến như trehalose, sucrose, glucose, mannitol, galactose, polyvinylpyrrolidone (PVP) và polyethylen glycol (PEG) [2].
2.1. Chất bảo vệ đông lạnh
Quy trình thuỷ tinh hoá noãn đã được nghiên cứu trên nhiều loại chất bảo vệ đông lạnh như ethylene glycol (EG), dimethylsulfoxide (DMSO), propylene glycol (PrOH), sucrose, ficoll hay trehalose. Phương pháp thủy tinh hóa được ứng dụng rộng rãi nhất đòi hỏi việc sử dụng nồng độ chất bảo vệ đông lạnh ban đầu cao, thể tích đông lạnh thấp và tốc độ đông lạnh – rã đông cực nhanh. Cho đến nay, một trong những quy trình được sử dụng nhiều nhất để thủy tinh hóa noãn người là sử dụng kết hợp 15% DMSO (2,1 M), 15% EG (2,7 M) và 0,5 M sucrose (hoặc trehalose) với thể tích đông lạnh tối thiểu (≤1 μl) [1]. Quy trình này cho phép sự thay đổi áp suất thẩm thấu chuyển từ độ thẩm thấu của môi trường nuôi cấy khoảng 280mOsm sang độ thẩm thấu của dung dịch cân bằng khoảng 2700 mOsm trong giai đoạn cân bằng giữa noãn và CPA, độ thẩm thấu tăng đáng kể vào khoảng 5600 mOsM ở dung dịch thủy tinh hóa trước khi noãn được đặt trực tiếp vào nitơ lỏng trên bất kỳ loại dụng cụ chứa nào. Trong quá trình rã đông, các thay đổi về độ thẩm thấu đột ngột giảm từ 5600mOsM xuống 1280mOsm trong dung dịch rã đông và sau đó trải qua các bước tái hydrat hoá để độ thẩm thấu về mức 780mOsM và sau đó là 280mOsM của môi trường nuôi cấy [3].
Sự dịch chuyển chất lỏng nhanh chóng mà không gây hư hỏng noãn là nhờ vào cấu trúc màng tế bào của noãn, chúng có đặc điểm về độ bền để chịu được lượng nước thay đổi đột ngột bên ngoài màng tế bào đến bên trong và ngược lại trong suốt quá trình đông lạnh và rã đông noãn [3].
2.2. Điều kiện tiếp xúc với CPA
Cũng quan trọng như các loại CPA, các điều kiện tiếp xúc với CPA như nồng độ, nhiệt độ tiếp xúc, thời gian tiếp xúc giữa noãn và CPA có thể ảnh hưởng đến chức năng và sự sống của tế bào. Để loại bỏ các tác động xấu từ CPA, loại CPA sử dụng cho đông lạnh noãn thường được kết hợp giữa EG và DMSO để đạt được nồng độ thấp nhất cần thiết từ mỗi CPA riêng lẻ. Mô hình trao đổi CPA từng bước đã được sử dụng rộng rãi cho quá trình thuỷ tinh hoá noãn người, với mục tiêu tạo ra một vi môi trường cho noãn tiếp xúc dần dần với CPA và các quá trình bù nước để giảm sự sốc thẩm thấu cũng như độc tính của CPA. Về thời gian, cần xác định thời gian tối thiểu cần thiết để noãn tiếp xúc hiệu quả với CPA, hiện nay hầu hết các quy trình có thể giảm xuống còn khoảng 1 phút trong lần trao đổi CPA cuối cùng để giảm tác động của các điều kiện thẩm thấu đến noãn [3].

3. Tác động của quá trình đông lạnh – rã đông đến chất lượng noãn
Tác động không mong muốn của quá trình đông lạnh – rã đông noãn được biết đến rõ ràng nhất và dễ dàng quan sát được chính là gây thoái hoá noãn, nguyên nhân noãn thoái hoá sau đông lạnh có thể do tác động trực tiếp của các tinh thể đá hoặc do sốc áp suất thẩm thấu trong quá trình trao đổi giữa noãn và CPA. Ngoài ra, quá trình đông lạnh và rã đông noãn cũng có thể làm thay đổi một số đặc điểm về sinh lý noãn như sự cứng lại của màng trong suốt (Zona pellucida), tổn thương thoi vô sắc, sự phân mảnh DNA, tổn thương bào quan nội bào, trinh sản hay lão hoá ở noãn [1].
3.1. Thay đổi cấu trúc
- Sự cứng lại của màng trong suốt
Khi quá trình trưởng thành của noãn được hoàn thành (noãn ở giai đoạn MII), các hạt vỏ của noãn được sắp xếp dưới màng trong suốt. Các hạt vỏ này có nguồn gốc từ Golgi, chúng đóng vai trò giải phóng các enzyme và mucopolysaccharide ồ ạt vào khoảng không quanh noãn sau các sự kiện hợp nhất giữa hai giao tử xảy ra sau khi thụ tinh, nhờ đó gây ra sự thay đổi sinh hoá làm màng trong suốt cứng lại nhằm ngăn chặn sự đa thụ tinh [2]. Những quan sát siêu cấu trúc của noãn đã ghi nhận số lượng hạt vỏ giảm đáng kể ở noãn sau rã đông, với gần 2/3 số lượng hạt vỏ đã được giải phóng trong noãn đông lạnh (cả đông lạnh chậm và thuỷ tinh hoá). Sự giải phóng phi sinh lý của các hạt vỏ là nguyên nhân làm cho màng trong suốt cứng lại, điều này gây khó khăn cho sự thụ tinh bình thường của noãn. Do đó noãn đông lạnh sau khi rã đông thường được chỉ định kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Intracytoplasmic Sperm Injection – ICSI) thay vì thụ tinh trong ống nghiệm (In-vitro fertilization – IVF) cổ điển nhằm hạn chế nguy cơ thất bại thụ tinh [1].
- Biến đổi cấu trúc của ty thể và phức hợp mạng lưới nội chất trơn
Các liên kết hỗn hợp giữa ty thể và màng tế bào chất được tìm thấy một cách đặc trưng trong noãn người trưởng thành hoàn toàn - được đặt tên là các tập hợp mạng lưới nội chất trơn của ty thể M-SER (mitochondria-smooth endoplasmic reticulum) và phức hợp MV (mitochondria-vesicle). Các tập hợp M-SER này có thể điều chỉnh nồng độ canxi và sản xuất ATP của ty thể, do đó có khả năng góp phần điều chỉnh các đường dẫn truyền tín hiệu phụ thuộc canxi khi thụ tinh. Vì vậy, những rối loạn về hình thái và chức năng của các tập hợp M-SER và phức hợp MV có thể dẫn đến giảm khả năng thụ tinh của noãn [3]. Noãn sau khi thủy tinh hóa thường được ghi nhận các tập hợp M-SER tương tự về kích thước, hình dạng và vị trí với những gì được quan sát trong noãn tươi. Nottola và cộng sự (2016) đã đánh giá siêu cấu trúc của noãn MII ở người trải qua quá trình đông lạnh chậm và rã đông ghi nhận ty thể không biểu hiện sự thay đổi cấu trúc rõ ràng, nhưng M-SER giảm dần sau khi rã đông, trong giai đoạn đầu và giữa của quá trình bù nước, trong khi phức hợp MV tăng lên ở giai đoạn này. Sau quá trình bù nước, không bào và phức hợp MV giảm, các tập hợp M-SER lại tăng lên. Các dấu hiệu này gợi ý một quá trình tái cấu trúc màng được đặc trưng bởi cơ chế chuyển tiếp, có khả năng chuyển đổi lẫn nhau giữa M-SER và MV dưới những thay đổi của môi trường [4].
Mặc dù tác động thực sự của những hiện tượng này đối với sinh lý noãn đông lạnh – rã đông vẫn còn nhiều hạn chế, các dữ liệu trên động vật cho thấy đông lạnh – rã đông noãn có tác động đến ty thể bằng cách làm thay đổi tính thấm ở màng ty thể, từ đó tăng giải phóng các gốc oxy hoá tự do, giảm sự phân cực ở màng ty thể [5]. Tuy nhiên sự hiểu biết chi tiết về tác động của đông lạnh – rã đông trên noãn người vẫn còn thiếu các dữ liệu. Một số báo cáo cho thấy đông lạnh – rã đông không ảnh hưởng trực tiếp đến siêu cấu trúc của ty thể mà thông qua sự tái cấu trúc màng nội bào liên quan đến các phức hợp MV và SER, có thể liên quan đến hiện tượng không bào ở noãn sau rã đông [4].
- Không bào
Không bào xuất hiện dưới dạng các cấu trúc rỗng, tròn không đều và được bao bọc bởi một màng. Về nguồn gốc, không bào có thể bắt nguồn từ sự phồng lên và sự hợp nhất của Golgi, màng SER hoặc kết hợp cả hai. Các không bào của noãn sau thủy tinh hóa cũng có thể được tạo ra từ các ty thể phồng lên hoặc từ sự hợp nhất của các hạt vỏ bị thoái hóa. Sau quy trình đông lạnh chậm hay thuỷ tinh hoá đều có thể có sự xuất hiện của không bào, tuy nhiên sự hiện diện của không bào trong quy trình thuỷ tinh hoá được ghi nhận là ít hơn so với đông lạnh chậm [1, 3]. 
Một số báo cáo ghi nhận sự xuất hiện của quá trình tạo không bào dường như liên quan đến thiết bị đông lạnh vì độ dẫn nhiệt độ có thể bị ảnh hưởng lớn bởi các vật liệu và thiết kế khác nhau (hệ thống đóng hoặc mở) của thiết bị đông lạnh. Không bào cũng hiện diện trong noãn già hoặc thoái hóa, trong khi ở các noãn không đông lạnh thường có rất ít hoặc hầu như không có không bào. Do đó, sự xuất hiện của không bào trong noãn sau thủy tinh hóa có thể được coi là một dạng tổn thương cấu trúc do phản ứng không đặc hiệu của noãn đối với các tổn thương trong quá trình đông lạnh hoặc noãn trải qua sự căng thẳng liên quan đến áp suất thẩm thấu. Mặc dù quá trình tạo không bào của noãn dường như có tác động xấu đến kết quả hỗ trợ sinh sản, nhưng nguồn gốc của không bào và sự hình thành không bào vẫn chưa được hiểu đầy đủ [3].
3.2. Tác động đến thoi vô sắc của noãn
Thoi vô sắc của noãn cực kỳ nhạy cảm với sự thay đổi nhiệt độ, đặc biệt là nhiệt độ thấp. Sự tiếp xúc nhanh chóng của noãn ở điều kiện nhiệt độ phòng có thể gây ra sự tổn thương không thể hồi phục của thoi vô sắc, việc sắp xếp lại các vi ống của thoi vô sắc là yếu tố cần thiết cho sự liên kết và phân chia nhiễm sắc thể chính xác sau khi thụ tinh [1]. Trong quá trình đông lạnh noãn, thoi vô sắc không chỉ tiếp xúc với nhiệt độ thấp mà còn có thể bị hư hỏng do sự hình thành các tinh thể đá. Mặc dù các ghi nhận cho thấy trong khi quá trình đông lạnh diễn ra, cấu trúc thoi vô sắc có thể được bảo tồn nếu noãn có tiếp xúc với CPA, tuy nhiên cấu trúc này sẽ dần biến mất trong quá trình rã đông. Điều này là xuất phát cho những lo ngại về tác động bất lợi của đông lạnh noãn đến sự ổn định của thoi vô sắc và có thể là nguyên nhân gây lệch bội ở phôi [3].
Nghiên cứu của Buderatska và cộng sự cho thấy việc đông lạnh noãn có thể làm tăng tỉ lệ lệch bội ở một số nhiễm sắc thể của noãn như nhiễm sắc thể số 13, 18 và nhiễm sắc thể giới tính [6]. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu khác báo cáo chưa ghi nhận sự gia tăng tỉ lệ lệch bội ở phôi có nguồn gốc từ noãn được bảo quản lạnh khi áp dụng đông lạnh chậm hoặc thủy tinh hóa [1].
3.3. Kích hoạt quá trình trinh sản
Trong sinh lý, sự hợp nhất giữa tinh trùng và noãn sẽ gây ra sự gia tăng nồng độ của các ion canxi nội bào, bắt đầu từ điểm tinh trùng xâm nhập và lan truyền theo kiểu sóng trên toàn bộ noãn. Mặc dù sự gia tăng Ca ²⁺ phần lớn là do giải phóng các ion canxi từ nguồn dự trữ bên trong tế bào, đặc biệt là từ các kho dự trữ trong mạng lưới nội chất, lượng Ca ²⁺ tăng cao này cũng có thể bắt nguồn từ môi trường bên ngoài hoặc từ sự kết hợp của cả hai. Tuy nhiên, nếu sự gia tăng nồng độ Ca ²⁺ được kích hoạt sớm trong noãn trưởng thành bởi các yếu tố môi trường, nó có thể gây ra sự kích hoạt quá trình trinh sản ở noãn [3].
3.4. Tính toàn vẹn của DNA
Tính đến thời điểm hiện tại, việc thuỷ tinh hoá noãn được xem là một trong những kỹ thuật thành công, tuy nhiên việc sử CPA nồng độ cao trong đông lạnh có thể gây ra những tác động đến tính toàn vẹn của DNA, điều này có thể là nguyên nhân gây ra các tổn thương đến DNA.
Nghiên cứu thực hiện đánh giá độc tính với gen (genotoxic) trong noãn trên ba loại CPA thủy tinh hóa EG, DMSO và PrOH cho kết quả với nồng độ PrOH cao (7,5 và 15%) có gây ra tổn thương DNA đáng kể trong noãn chuột bất kể thời gian tiếp xúc với CPA, quá trình thủy tinh hóa noãn bằng PrOH gây ra tổn thương DNA nhiều hơn đáng kể so với các quy trình thủy tinh hóa sử dụng EG hay DMSO. Các cơ chế chính xác gây ra độc tính với gen của các chất bảo vệ đông lạnh vẫn đang được xác định và do đó việc lựa chọn CPA cho quá trình thủy tinh hóa noãn người cho đến khi có thêm các nghiên cứu về độc tính với gen và đánh giá dài hạn là rất cần thiết [3].

4. Kết luận
Đông lạnh noãn là một trong những kỹ thuật thành công và đóng vai trò quan trọng trong hỗ trợ sinh sản trong những thập kỷ qua. Theo các bằng chứng hiện có, thuỷ tinh hoá được xem là quy trình tiêu chuẩn dùng để tham khảo trong đông lạnh noãn. Bên cạnh những lợi ích về nhóm đối tượng được chỉ định đông lạnh noãn, những vấn đề liên quan đến tác động của quá trình đông lạnh và rã đông noãn cũng cần được quan tâm, có thể kể đến một số tác động như thay đổi cấu trúc noãn, tác động đến thoi vô sắc của noãn, kích hoạt quá trình trinh sản hay liên quan đến tính toàn vẹn của DNA. Việc hiểu rõ những lợi ích và tác động của quy trình đông lạnh đến noãn là nền tảng cho sự phát triển của kỹ thuật trong tương lai.
Tài liệu tham khảo:

1. Iussig, B., Maggiulli, R., Fabozzi et al. A brief history of oocyte cryopreservation: Arguments and facts. Acta obstetricia et gynecologica Scandinavica. 2019; 98(5), 550-558.
2. Sciorio, R., Pluchino, N., & Fuller, B. J. Review of human oocyte cryopreservation in ART programs: Current challenges and opportunities. Cryobiology. 2023; 104590.
3. Chang, C. C., Shapiro, D. B., & Nagy, Z. P. The effects of vitrification on oocyte quality. Biology of Reproduction. 2022; 106(2), 316-327.
4. Belli, M., Palmerini, M. G., Bianchi, S., Bernardi, S., Khalili, M. A., Nottola, S. A., & Macchiarelli, G. Ultrastructure of mitochondria of human oocytes in different clinical conditions during assisted reproduction. Archives of Biochemistry and Biophysics. 2021; 703, 108854.
5. Gualtieri R, Kalthur G, Barbato V et al. Mitochondrial Dysfunction and Oxidative Stress Caused by Cryopreservation in Reproductive Cells. Antioxidants (Basel). 2021 Feb 24; 10(3):337.
6. Buderatska, N., Gontar, J., Ilyin et al. Does human oocyte cryopreservation affect equally on embryo chromosome aneuploidy?. Cryobiology. 2020; 93, 33-36.

Từ khóa: Ảnh hưởng của quá trình đông lạnh và rã đông đến chất lượng noãn